Hochest 33342即用型染色液

Hochest 33342 Stain RTU Solution,10 μg/ml

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342 或HOE 33342，分子式為C₂₇H₂₈N₆O·3HCl ，分子量MW561.93，CAS: 23491-52-3，是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342 專一性地與雙鏈DNA結(jié)合（優(yōu)先結(jié)合AT），常用于細(xì)胞核染色。染色后可以用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Hoechst 33342 的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346 nm（紫外激發(fā)），最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm（藍(lán)色熒光）；Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。另外，由于Hoechst 33342專一性結(jié)合DNA，不與RNA結(jié)合，樣品無需使用RNase處理。與DAPI相比，Hoechst 33342具有更好的膜通透性，更適合于活細(xì)胞的染色。

Hoechst 33342和Hoechst 33258相比，Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細(xì)胞時(shí)容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來說Hoechst 33258用于細(xì)胞固定后再染色，而Hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色。

本染色液為即用型，濃度為10 μg/ml，可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。

● 貯存：

-20℃避光保存，一年有效。

● 操作步驟：

一.固定后的細(xì)胞樣品染色：

1.1 貼壁細(xì)胞：

1.1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，無菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，生長(zhǎng)至50%-80%滿度。

1.1.2刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過夜)。

1.1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。

1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33342染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。

1.1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

1.1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測(cè)。

1.2懸浮細(xì)胞：

1.2.1 500 g（2400 rpm，下同）離心收集凋亡處理后細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，常溫固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過夜)。

1.2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.2.3 細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33342染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.2.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl PBS中。

1.2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟1.2.4染色后細(xì)胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā)，可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測(cè)。

二.活細(xì)胞染色：

2.1 加入適當(dāng)量Hoechst 33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對(duì)于六孔板一個(gè)孔需加入1 ml染色液，對(duì)于96孔板一個(gè)孔需加入100微升染色液。

2.2 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液，用PBS洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察會(huì)看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

HeLa細(xì)胞染色圖。圖A為正常細(xì)胞Hoehst 33342的染色效果圖。圖B中除了正常細(xì)胞外，還清晰可見呈現(xiàn)致密濃染的凋亡細(xì)胞。

操作流程： Jurkat細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×10⁶/ml；500 g 3 min收集2 ml 細(xì)胞；細(xì)胞沉淀中加入1 ml卡諾固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細(xì)胞沉淀中加入200 μl Hoechst 33342即用型染色液（10 μg/ml）；37度避光染色10 min； 離心后細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細(xì)胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀察。