細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒(Apoptosis and Necrosis Assay Kit)可以快速檢測(cè)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死。本試劑盒采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染的方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)固縮。Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。碘化丙啶(PI)不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，碘化丙啶(PI)可以染色壞死細(xì)胞。上述兩種染料雙染后，使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)，正常細(xì)胞為弱紅色熒光＋弱藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞為弱紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光，壞死細(xì)胞為強(qiáng)紅色熒光＋強(qiáng)藍(lán)色熒光。

按照每個(gè)樣品細(xì)胞數(shù)量100萬(wàn)計(jì)算，該試劑盒可以使用100次。

● 貯存：

避光按照標(biāo)簽溫度保存，一年有效。

● 操作步驟：

一. 貼壁細(xì)胞：

1.1在培養(yǎng)液中（細(xì)胞數(shù)量控制在10⁶以內(nèi)）均勻滴加適量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，輕柔混勻。例如對(duì)于十二孔板中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，每孔有1 ml的培養(yǎng)液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培養(yǎng)液中的血清、酚紅等都不會(huì)對(duì)染色產(chǎn)生干擾。

1.2混勻，37℃培養(yǎng)15分鐘，直接在顯微鏡下觀察；如果考慮到液體對(duì)拍照的乙酰個(gè)，可以吸除含染料的培養(yǎng)液，用染色緩沖液洗滌2-3次即可在熒光顯微鏡下觀察。

注：為避免凋亡細(xì)胞隨培養(yǎng)液或染色緩沖液被吸除，在吸除液體前，對(duì)于用多孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，最好用多孔板離心機(jī)離心一下以充分沉淀那些已經(jīng)漂浮起來(lái)的凋亡細(xì)胞。

二. 懸浮細(xì)胞：

2.1 在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量的Hoechst 33342染色液和PI染色液，輕柔混勻。例如對(duì)于十二孔板中培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，每孔有1 ml的培養(yǎng)液，每孔需要加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl PI染色液。培養(yǎng)液中的血清、酚紅等都不會(huì)對(duì)染色產(chǎn)生干擾。

2.2混勻，37℃培養(yǎng)15分鐘，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，500 g 離心5分鐘收集細(xì)胞。

2.3細(xì)胞沉淀用細(xì)胞染色緩沖液洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。

2.4細(xì)胞沉淀中加入100 μl 細(xì)胞染色緩沖液，重懸沉淀。

2.5取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟2.4染色后細(xì)胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

2.6 熒光顯微鏡下觀察。

注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)示例：

293 細(xì)胞Hoechst/PI雙染檢測(cè)

 操作程序：293細(xì)胞胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁵/ml。接種到12孔板，1ml每孔，37度5%二氧化碳培養(yǎng)40小時(shí)，加入5 μl Hoechst 33342染色液和5 μl 碘化丙啶染色液，37度培養(yǎng)15分鐘，熒光顯微鏡觀察（40×）。